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珍藏版【上集】染色體外環狀DNA的研究歷程、功能機制和研究方法
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2019-12-11 | 812 次瀏覽 | 分享到:

環狀DNA是自然界普遍存在的一種DNA分子形式,例如細菌或酵母等微生物的基因組DNA、細菌質粒、線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)等等都是環狀DNA分子。真核生物中還有一類特殊的環狀DNA分子,它們是從正常基因組中分離或脫落下來,游離于染色體基因組之外,以特殊的方式參與生理或病理過程。由于它們是在染色體之外獨立存在的DNA分子,因此統稱為染色體外DNA,又常常是環狀的,因此稱其為染色體外環狀DNA(extrachromosomal circular DNA, eccDNA)。染色體外DNA在很多物種中均存在,包括酵母、線蟲、果蠅、哺乳動物、植物等等([1])。eccDNA往往在腫瘤和衰老過程中富集,以特殊的方式參與腫瘤和衰老的發生發展進程([1]),因此備受關注。本文對eccDNA的發現歷程、主要特征、功能機制和研究方法進行匯總。


 
1、eccDNA的發現歷程

eccDNA并不是最近才發現的,最早可追溯到1965年。當時Hotta, Y.等從麥胚和豬精子中發現了染色體外環狀DNA分子([2])。同一年,Cox, D.等報道從人的腫瘤標本細胞中發現了染色體外的DNA分子,它們具體經常是成對出現的,因此當時稱其為雙微體(double-minutes)([3])。此后陸續在很多物種中都發現了染色體外環狀DNA分子。隨著分子克隆技術的發展和成熟,人們開始對雙微體的分子功能展開了研究。1978年,Alt, F. W.等報道發現氨甲喋呤耐藥的小鼠細胞存在攜帶DHFR基因的雙微體,這些雙微體的存在導致了DHFR基因的擴增,介導了小鼠細胞對氨甲喋呤的耐藥([4])。這是首次報道雙微體(eccDNA)的作用機制。1983年,Kohl, N. E.報道神經母細胞瘤中存在攜帶MYCN的雙微體([5])。此后多項研究發現雙微體可攜帶癌基因,包括EGFR和c-Myc等等([1])。多項研究也表明這種染色體外DNA分子常以環狀DNA的形式存在,進一步的研究發現人類染色體外DNA其實只有大約30%的是以雙微體的形式存在的,因此上面提到的雙微體概念漸漸被染色體外環狀DNA的表述替代了([1])。Episome是eccDNA的另一種表述形式,目前認為episome是eccDNA的前體分子形式([1])。


圖1人類腫瘤細胞中存在雙微體(eccDNA)([3]


人類基因組計劃的完成和二代測序技術的興起帶動了eccDNA的發展。2012年,Shibata, Y.等報道從小鼠和人的細胞中發現了一類小的染色體外環狀DNA分子,它們大小在200-400bp不等的染色體外環狀DNA,但這些DNA分子與上述的eccDNA并不一致,他們稱其為microDNA([6])。2014年,Paul S. Mischel團隊發現膠質瘤細胞中存在攜帶EGFRvIII突變型基因的eccDNA,介導了EGFR抑制劑耐藥([7])。2017年,Paul S. Mischel團隊對17種腫瘤的2572種細胞系的全基因組測序分析,發現超過一半的人類腫瘤中存在eccDNA,這些eccDNA分子經常攜帶腫瘤驅動基因([8])。2018年,Moller, H. D.等報道從健康人的肌肉和血液細胞中分離到超過十萬種的eccDNA分子,它們絕大部分都攜帶基因或基因的片段,長度往往小于25kb([9])。這一報道表明eccDNA可能普遍存在。2019年,Paul S. Mischel團隊報道eccDNA存在顯著的染色體開放狀態和更遠距離相互作用的形式,提高了對eccDNA的作用機制認識([10])。同期,Jeremy N. RichPeter C. Scacheri等對eccDNA中染色質結構和增強子狀態進行了分析,表明eccDNA中非編碼區的增強子功能也在eccDNA所攜帶的癌基因表達調控中發揮功能,也進一步表明了eccDNA特殊的染色質結構及其功能([11])。eccDNA研究過程中一些重要的發現可用下圖的時間軸展示:

圖2 eccDNA的主要研究歷程

 
2、
eccDNA的主要特征

2.1 染色體外環狀DNA的大小和分類

染色體外DNA是泛指所有染色體基因組之外的DNA物質,也包含了線粒體DNA,一些病毒基因組環狀DNA等。除了這些與核基因組序列不同的DNA分子,其余的根據分子大小大致可分為三類:

(1)小于1kB的microDNA分子,包括小分散環狀DNA(small polydispersed circular DNA,spcDNA),B-細胞或T-細胞成熟中形成的小環狀DNA,端粒序列形成的小環狀DNA分子,轉座子元件形成的環狀DNA分子等等,這類分子通常小于500bp,往往不攜帶完整的基因序列([1])。

(2)從幾kb到幾Mb范圍的eccDNA分子,目前對eccDNA的大小還沒有定論,主要認為分布在1kb~5Mb范圍內([10, 12]),但不同的文獻報道中表述略有差別。它們往往是一些特殊的基因區域形成的,可攜帶完整的基因和特殊的調控元件,能獨立完成復制過程,但不攜帶著絲粒和端粒結構。本文中若不特殊說明,所有的eccDNA均代表這一類的分子。

(3)帶有著絲粒和端粒結構的迷你染色體(minichromosomes)([1])。


2.2 eccDNA的結構特點 

早期對eccDNA或雙微體結構認識比較局限,主要發現它們是環狀DNA分子,并且往往是一些基因擴增的產物,其中也包含著DNA復制起始點,因此可以獨立完成復制作用。2019年,Paul S. Mischel團隊Nature文章以及Peter C. ScacheriJeremy N. Rich聯合發表的Cell文章對eccDNA的結構有了較為深刻的探索分析,eccDNA不僅攜帶了完整的基因,還攜帶了基因上游的啟動子和增強子元件[10, 11])。eccDNA的染色質結構更加松散,H3K27ac狀態更高([11]),其中的電鏡照片也清楚的顯示eccDNA為游離在染色體之外的環狀DNA分子([10])。

圖3  eccDNA是一種環狀的DNA分子 ([10]


2.3 eccDNA的形成機制

早期的研究就發現eccDNA是基因擴增的產物,是基因組不穩定性的一種表現形式。腫瘤基因擴增往往以兩種方式,一種是在均質染色區域(homogeneously staining regions,HSR)進行基因的擴增,另一種則是形成eccDNA(雙微體)([13])。目前關于腫瘤中HSR區和eccDNA基因擴增現象的分子機制還沒有定論,一種可能的機制是基因組結構的一次“災難性”事件(chromothripsis)有關([14])。早期的研究認為短重復序列是介導eccDNA形成的因素,主要通過基因重組機制實現,也有一些模型認為是在DNA復制過程中通過loop切除或在DNA復制暫停的時候復制泡中斷裂的DNA片段連接形成([15])。早期的理論認為DNA復制是形成eccDNA所必需的,但有的研究中卻發現DNA復制的抑制劑會促進eccDNA的形成,也有研究發現eccDNA的形成過程完全不依賴DNA復制作用([12])。有研究發現線菌酮,致癌劑或者DNA復制抑制劑(羥基脲)會促進eccDNA的生成([16]),范可尼貧血病人eccDNA顯著增多,長度也更長([17]),這也說明eccDNA的形成可能是多種機制作用的結果。有趣的是c-Myc基因能促進eccDNA的生成[18])。Anindya Dutta等在他們的一篇綜述文章中用示意圖展示了各種可能形成eccDNA的分子模型,如下圖所示:

圖4 eccDNA形成機制示意圖([12]


2.4 eccDNA的序列來源

早期的研究就曾發現eccDNA所攜帶的序列不是單一基因組位點來源的,而是同時攜帶了多個位點的序列。2014年,Tiziana Storlazzi等在Nucleic Acids Research的文章結合了高通量SNP測序技術,FISH雜交和PCR技術分析了不同細胞中攜帶Myc基因的eccDNA,發現即使同一細胞樣品中也會存在攜帶不同染色質序列的eccDNA分子,呈現高度的異質性。作者還利用他們的生物信息學工具分析了所研究樣本中HSR和eccDNA的序列特征,排除了這些基因擴增現象是由chromothripsis驅動形成的可能,他們認為HSR和eccDNA的形成是一個持續不斷進行的事情([19])。因此,eccDNA并不是簡單的基因組序列脫落后自連的產物,是經歷過很多步驟后形成的。

圖5 eccDNA攜帶基因組多個位置的序列 ([19]


2.5 eccDNA基因的表達特征

eccDNA可以攜帶完整的基因,尤其是腫瘤中經常攜帶致癌的驅動基因,通過不受控制的表達這些基因,最終導致腫瘤不受調控的惡性增長。eccDNA是基因擴增的一種形式,對癌基因的表達增高的有重要貢獻。早期的研究聚焦于發現eccDNA的存在,并且是癌基因擴增的重要形式,認為這對癌基因表達的貢獻主要是由于基因拷貝數的增加所致。2019年,Paul S. Mischel團隊Nature文章發現,eccDNA對癌基因的表達增高不僅僅由于基因拷貝數的升高,還包括eccDNA中基因過度表達的因素,表現為即使用基因拷貝數進行歸一化處理,eccDNA來源的基因表達數目也遠高于基因組中的表達狀況([10])。因此,eccDNA對癌基因的過度表達既有拷貝數增加的因素,更有eccDNA本身高度轉錄活性的貢獻。這一特征也能從Peter C. ScacheriJeremy N. Rich聯合發表的Cell文章中得到支持。


圖6  eccDNA通過拷貝數增加和過度轉錄促進癌基因表達 ([10]

參考文獻

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